Phản ứng chuỗi polymerase (pcr) là gì? sự thật trong bài kiểm tra, các bước và được sử dụng cho

PCR (phản ứng chuỗi polymerase) là gì?

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại lượng dấu vết DNA (và trong một số trường hợp, RNA) nằm trong hoặc trên hầu hết mọi chất lỏng hoặc bề mặt nơi các chuỗi DNA có thể được lắng đọng. Chìa khóa để hiểu PCR là phải biết rằng mọi người, động vật, thực vật, ký sinh trùng, vi khuẩn hoặc vi rút đều chứa vật liệu di truyền như trình tự DNA (hoặc RNA) (trình tự nucleotide hoặc đoạn DNA hoặc RNA) là duy nhất cho loài của chúng, và cho các thành viên cá nhân của loài đó. Do đó, nếu một mẫu chứa các phân đoạn DNA hoặc RNA, PCR là phương pháp được sử dụng để khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao giống hệt nhau hơn) của các chuỗi duy nhất này để chúng có thể được sử dụng để xác định với xác suất rất cao về nguồn gốc (a người cụ thể, động vật hoặc sinh vật gây bệnh) của DNA hoặc RNA dấu vết được tìm thấy trong hoặc trên hầu hết mọi mẫu vật liệu.

Tuy nhiên, khuếch đại PCR chỉ là một phần của xét nghiệm xác định. Sau khi khuếch đại được thực hiện (xem bên dưới), các phân đoạn khuếch đại cần được so sánh với các phân đoạn nucleotide khác từ một nguồn đã biết (ví dụ, một người cụ thể, động vật hoặc sinh vật gây bệnh). Việc so sánh các phân đoạn duy nhất này thường được thực hiện bằng cách đặt các chuỗi nucleotide do PCR tạo ra bên cạnh các chuỗi nucleotide đã biết từ người, mầm bệnh hoặc các nguồn khác trong một gel tách. Dòng điện được chạy qua gel và các chuỗi nucleotide khác nhau tạo thành các dải giống như một "bậc thang" theo điện tích và kích thước phân tử của chúng. Điều này được gọi là điện di gel. Các dải hoặc "bậc thang" giống như các bước di chuyển đến cùng cấp độ trong gel cho thấy bản sắc của các chuỗi nucleotide. Phương pháp này là một trong những cách phổ biến nhất để kiểm tra PCR được hoàn thành (Xem Hình 1).

Hình 1, Các dải hoặc "bậc thang" giống như các bước của PCR tạo ra DNA của Mycobacterium (theo CDC)

Nhân vật. Các yếu tố lặp đi lặp lại (Rep), PCPCR (A) và điện di trên trường xung (PFGE) (B) của Mycobacterium Cosmeticsum phân lập từ 2 bệnh nhân ở Ohio và 1 bệnh nhân ở Venezuela. Rep-PCR được thực hiện bằng cách sử dụng primer BOXA1R (3) và PFGE được thực hiện với enzyme hạn chế AseI. Lanes 1, 2, Ohio phân lập OH1 và OH2; làn 3, 4, các chủng kiểm soát ATCC BAA-878T và ATCC BAA-879; ngõ 5, Venezuela cách ly VZ1. Tiêu chuẩn kích thước DNA là 100-bp (S1) và 48, 5-kb (S2).

PCR (phản ứng chuỗi polymerase) được thực hiện như thế nào?

Năm 1983, Kary Mullis đã tìm ra các bước cơ bản để khuếch đại trình tự DNA. Ông và Michael Smith đã được trao giải thưởng Nobel vì đã phát triển thủ tục này vào năm 1993. Có một vài bước cơ bản được thực hiện theo trình tự; PCR có thể được thực hiện trong một ống duy nhất với các hóa chất thích hợp và lò sưởi được thiết kế đặc biệt. Các thuốc thử hoặc hóa chất cần thiết như sau:

• Một mẫu có chứa một chuỗi nucleotide (từ máu, tóc, mủ, cạo da, v.v.)
• Đoạn mồi DNA: DNA chuỗi đơn ngắn gắn vào trình tự nucleotide thúc đẩy tổng hợp chuỗi nucleotide bổ sung
• DNA polymerase: một loại enzyme, khi DNA có liên kết mồi, đi xuống đoạn DNA gắn các khối xây dựng DNA để tạo thành các cặp cơ sở bổ sung và do đó tổng hợp chuỗi DNA nucleotide bổ sung (giới thiệu DNA polymerase chịu nhiệt, Taq polymerase, có nguồn gốc từ vi khuẩn chịu nhiệt, cải thiện rõ rệt khả năng thực hiện PCR)
• Một lượng lớn các khối xây dựng DNA được gọi là nucleotide (Adenine, Thymidine, Cytosine và Guanine, được viết tắt là: A, T, C và G, tương ứng) có trong dung dịch. Khi các khối này được liên kết với nhau, chúng tạo thành một chuỗi nucleotide hoặc một chuỗi DNA duy nhất. Khi các khối xây dựng này liên kết khối xây dựng bổ sung của chúng bằng các liên kết hydro yếu (ví dụ, A sẽ chỉ liên kết với T và G chỉ với C), một chuỗi nucleotide DNA bổ sung được hình thành và liên kết với DNA chuỗi đơn ban đầu. Khi liên kết được hoàn thành, một chuỗi DNA kép bổ sung được hình thành theo một trình tự cụ thể.

PCR, sau đó, bắt đầu với một đoạn DNA từ một mẫu được đặt trong ống với các thuốc thử được liệt kê ở trên. Dung dịch được gia nhiệt đến ít nhất 94 C (201.2 F); nhiệt này phá vỡ các liên kết hydro cho phép các chuỗi DNA bổ sung hình thành, do đó chỉ có các chuỗi đơn tồn tại trong hỗn hợp (điều này được gọi là biến tính DNA chuỗi kép).

Hỗn hợp này được làm mát đến khoảng 54 C (129, 2 F). Ở nhiệt độ này, các đoạn mồi DNA và DNA polymerase liên kết với các chuỗi DNA đơn lẻ (điều này được gọi là ủ DNA). Do các khối xây dựng vượt quá (nồng độ cao) trong hỗn hợp, polymerase sử dụng chúng để tạo ra các chuỗi DNA bổ sung mới (được gọi là mở rộng DNA) và quá trình này diễn ra nhanh hơn ở 72 C (161, 6 F). Quá trình này tạo ra một phân tử DNA sợi kép mới từ mỗi chuỗi đơn của phân tử ban đầu.

Chu trình này được lặp lại khoảng 40 lần trong một máy được gọi là chu trình nhiệt tự động lặp lại các chu trình làm mát, với số lượng mỗi chuỗi DNA tăng gấp đôi mỗi lần hoàn thành chu trình làm mát. Những gì ban đầu là một đoạn DNA ngắn có thể được khuếch đại lên khoảng 100 tỷ bản sau 40 chu kỳ nhân đôi.

Tại sao bác sĩ lại yêu cầu xét nghiệm PCR (phản ứng chuỗi polymerase)?

Xét nghiệm PCR tạo thành cơ sở của một số xét nghiệm có thể trả lời nhiều câu hỏi y tế khác nhau giúp các bác sĩ chẩn đoán và điều trị bệnh nhân. Ví dụ, xét nghiệm PCR có thể phát hiện và xác định các sinh vật gây bệnh ở bệnh nhân, đặc biệt là những sinh vật khó nuôi cấy (ví dụ, HIV và các loại virus khác và một số loại nấm).

Các bác sĩ khác đặt hàng các xét nghiệm PCR để giúp chẩn đoán các bệnh di truyền, trong khi các bác sĩ khác sử dụng PCR để phát hiện các mối quan hệ sinh học như xác định cha mẹ của trẻ em. Các xét nghiệm PCR cũng được sử dụng để xác định và mô tả các đột biến di truyền và sắp xếp lại được tìm thấy trong một số bệnh ung thư.

Tuy nhiên, các xét nghiệm PCR đã được sửa đổi và mở rộng sang nhiều khía cạnh của các nghiên cứu khoa học bao gồm sinh học tiến hóa, dấu vân tay di truyền, điều tra pháp y và nhiều khía cạnh khác.

RT-PCR là gì?

RT-PCR là một xét nghiệm PCR được thiết kế để phát hiện và đo RNA. Mặc dù các xét nghiệm PCR ban đầu đã khuếch đại DNA, nhiều loại virus và các thành phần sinh học khác (ví dụ, ty thể) sử dụng RNA làm vật liệu di truyền. RT-PCR khác với PCR thông thường bằng cách đầu tiên lấy RNA và chuyển đổi chuỗi RNA thành chuỗi DNA. Điều này được thực hiện bằng phương pháp cơ bản tương tự cho PCR được mô tả ở trên, ngoại trừ việc sử dụng enzyme được gọi là enzyme sao chép ngược thay vì DNA polymerase. Phiên mã ngược cho phép một chuỗi RNA duy nhất được dịch thành chuỗi DNA bổ sung. Khi phản ứng đó xảy ra, phương pháp PCR thông thường có thể được sử dụng để khuếch đại DNA. RT-PCR đã được sử dụng để phát hiện và nghiên cứu nhiều loại virus RNA.

RT-PCR không nên nhầm lẫn với một biến thể khác của PCR, được gọi là PCR thời gian thực. Real-Time PCR là một biến thể của PCR cho phép phân tích DNA được khuếch đại trong 40 chu kỳ thông thường của quy trình. Mặc dù quy trình này tương tự như PCR thông thường với chu kỳ, nhưng Real-Time PCR sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang gắn vào một số khối xây dựng hoặc các chuỗi nucleotide nhỏ. Tùy thuộc vào phương pháp được sử dụng, huỳnh quang xảy ra khi các chuỗi DNA được khuếch đại được hình thành. Lượng huỳnh quang có thể được đo trong suốt 40 chu kỳ và cho phép các nhà điều tra đo các sản phẩm cụ thể và lượng của chúng trong các chu kỳ khuếch đại. Điều này thường cho phép các nhà điều tra hoặc kỹ thuật viên phòng thí nghiệm bỏ qua điện di gel hoặc các thủ tục thứ cấp khác cần thiết để phân tích các sản phẩm PCR, do đó tạo ra kết quả nhanh hơn.

Real-Time PCR và RT-PCR là các biến thể hoặc sửa đổi của xét nghiệm PCR gốc. Tuy nhiên, có nhiều biến thể khác (ít nhất 25) tồn tại và được sử dụng để giải quyết các vấn đề cụ thể. Chúng đều có các tên khác nhau như PCR hội, PCR khởi động nóng, PCR đa pha, PCR pha rắn và nhiều loại khác.

PCR có khả năng tiếp tục được sửa đổi để giúp trả lời bất kỳ câu hỏi nào khác trong y học, sinh học. và các lĩnh vực nghiên cứu khác.